時間：2021.10.29

　　博奧麥斯一直秉承緊跟前沿技術的準則，現(xiàn)重磅推出新技術—— DIA 磷酸化定量修飾組技術，為您的科研助力！

　　蛋白質(zhì)磷酸化修飾是生物體內(nèi)存在最為廣泛的一種翻譯后修飾類型，調(diào)節(jié)了包括細胞增殖、發(fā)育、分化、信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡、神經(jīng)活動等過程在內(nèi)的所有活動。分析研究蛋白質(zhì)的磷酸化修飾狀態(tài)，有助于進一步挖掘與疾病發(fā)生發(fā)展相關的重要生物標志物。但是DDA技術的半隨機性使得磷酸化蛋白質(zhì)組學的重復性在大量樣本的檢測中具有一定挑戰(zhàn)性。隨著快速掃描高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜儀的出現(xiàn)，DIA技術已成為蛋白質(zhì)組學的新寵。DIA可以無遺漏、無差異地獲得樣本中所有離子的全部碎片信息，數(shù)據(jù)利用度大大提高，缺失值更少。于是，DIA磷酸化蛋白質(zhì)組走上舞臺。

　　那DIA磷酸化蛋白質(zhì)組有什么突出的優(yōu)勢呢？讓我們從文獻中一探究竟。

　　案例一、DIA磷酸化技術開發(fā)研究

　　2020年哥本哈根大學健康與醫(yī)學科學院蛋白研究中心Jesper V. Olsen團隊在《Nature Communications》發(fā)表了題為“Rapid and site-specific deep phosphoproteome profiling by data-independent acquisition without the need forspectral libraries”的研究論文。首次應用了DIA磷酸化蛋白質(zhì)組分析方法，將DIA從蛋白質(zhì)分析延伸至磷酸化蛋白質(zhì)組分析。其可以分為建庫法和非建庫法（又稱“dDIA”）。此研究通過優(yōu)化單次分析工作流程鑒定了高于DDA三倍的母離子（28765 : 9048）和兩倍的磷酸肽（13220 : 7285），重現(xiàn)性也高于DDA方法（R2=0.93 : R2=0.89）。為了證明此處開發(fā)的基于DIA的快速位點特異性磷酸蛋白質(zhì)組學工作流程的強大功能和可擴展性，使用30種激酶抑制劑將其應用于表皮生長因子信號通路中的十種主要蛋白激酶的磷酸化位點。用兩種不同濃度（0.1和1μM）的抑制劑預處理表皮生長因子刺激的RPE1細胞，并用LC-MS/MS對每個樣品進行DIA分析。結果表明有化合物的表皮生長因子受體抑制（EGFRi）效果良好。為了進一步驗證激酶抑制劑的特異性，分析了單個激酶的已知底物，結果表明了良好的重復性。證明DIA磷酸化可以真實的反應生物學調(diào)控過程。

　　案例二、通路機制相關研究

　　2020年，浙江省重癥肝胰腺疾病診治重點實驗室，應用DDA和DIA對對照組和重癥急性胰腺炎（SAP）組之間差異表達的磷酸化蛋白進行了定量分析。結果表明DIA優(yōu)于DDA，鑒定出的磷酸化多肽數(shù)量增加了近1.76倍。DDA鑒定的98.48%的磷酸化肽段和98.77%磷酸化蛋白同時也被DIA發(fā)現(xiàn)。DIA鑒定出的99.25%磷酸化肽和86.17%的磷酸化蛋白與DDA鑒定相同，僅75個磷酸化肽被DDA唯一鑒定。對于磷酸化位點鑒定，DDA數(shù)據(jù)包含5491個磷酸化絲氨酸（PS）、669個磷酸化蘇氨酸（PT）和25個磷酸化酪氨酸（Py）殘基，但是少于DIA數(shù)據(jù)，后者包含9603個磷酸化絲氨酸、1628個磷酸化蘇氨酸和51個磷酸化酪氨酸殘基。磷酸化蛋白的GO功能分析和通路分析顯示內(nèi)分泌系統(tǒng)、信號轉(zhuǎn)導、細胞生長和死亡、運輸和分解代謝占較大比例。隨后的GSEA分析表明分別來自蛋白質(zhì)組學和磷酸蛋白質(zhì)組的21個和10個gene groups在SAP中顯著上調(diào)。揭示SAP磷酸蛋白groups中核因子KappaB（NFkB）的激活在胰腺炎的早期發(fā)展和持續(xù)發(fā)展過程中起著至關重要的作用，調(diào)節(jié)NFKB的活性可能是一種可行的治療方案。

　　案例三、藥物耐受相關研究

　　今年5月，臺灣大學Yu-Ju Chen團隊同樣在《Nature Communications》發(fā)表了題為“A data-independent acquisition-based global phosphoproteomics system enables deep profiling”的學術文章。研究者通過DIA磷酸化蛋白質(zhì)組學技術，利用肺癌細胞系和患者來源的組織，單次DIA磷酸化實驗實現(xiàn)了38255個亞磷酸肽（20420個一級亞磷酸肽）的深度量化。使用合成磷酸肽對DIA定量性能進行測試，高相關性和高重新性表明了DIA磷酸化技術的高準確性。使用NSCLC PC9和CL68細胞裂解產(chǎn)物，評估單次DIA分析在磷酸化蛋白質(zhì)組覆蓋率、CV%和數(shù)據(jù)完整性方面的定量性能。PC9 細胞中的單次DDA分析定量出17430個磷酸肽，對應于12959個磷酸位點（10768個1類位點），但只有53%的位點在20% CV 的三次重復中可重現(xiàn)。dDIA分析實現(xiàn)了19024個磷酸化位點（9746個1類位點），并且在20%的CV內(nèi)定量了高達90%。建庫法DIA鑒定出33330個磷酸位點（17810個1類位點），并且79%在20%的CV內(nèi)被定量，1類磷酸位點鑒別量比分別使用DDA和dDIA高出1.9倍和1.6倍。隨后，在蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組水平建立EGFR-TKI耐藥細胞模型，并區(qū)分新激酶和底物的表達和位點特異性磷酸化的變化。DIA在蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組水平上實現(xiàn)了對EGFR-TKI耐藥細胞模型的高靈敏且高度可重復的分析，揭示了EGFR-TKI 耐藥途徑的高覆蓋率，并區(qū)分了新型激酶和底物的表達和位點特異性磷酸化的改變。對患者的高度異質(zhì)性腫瘤和正常組織定量分析也揭示了DIA技術在用于了解疾病機制和挖掘潛在藥物靶點的能力。此方法同樣可以拓展應用于其他癌癥。

　　從文獻數(shù)據(jù)中不難看出，DIA技術鑒別磷酸化肽段以及磷酸化位點，都遠遠優(yōu)于傳統(tǒng)DDA技術，從激酶研究到藥物靶點研究，從動物模型組織到臨床研究，DIA技術都展現(xiàn)了其不可或缺的優(yōu)勢。這得益于其快速、準確、高通量的優(yōu)點。

　　不管是激酶分析、靶點篩選還是復雜的臨床大隊列研究，DIA磷酸化蛋白質(zhì)組均能幫助您快速、準確的解決問題。

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　　參考文獻[1] Bekker-Jensen D B , Bernhardt O M , Hogrebe A ,et al. Rapid and site-specific deep phosphoproteome profiling bydata-independent acquisition without the need for spectral libraries[J]. NatureCommunications, 2020, 11(1).[2] Improved Integrated Whole Proteomic andPhosphoproteomic Profiles of Severe Acute Pancreatitis[J]. Journal of ProteomeResearch, 2020, 19(6):2471-2482.[3] Kitata R B , Choong W K , Tsai C F , et al. Adata-independent acquisition-based global phosphoproteomics system enables deepprofiling[J].Nature Communications.