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DIA定量蛋白組

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> 技術簡介

　　DIA是最近幾年新發展的一種質譜數據采集方式，是目前最熱門的蛋白質組技術，該技術被Nature Methods雜志評為2015年最值得關注的技術。對于臨床研究中數量龐大的、復雜的、個體差異大的樣本，DIA提供條件統一、無差別的質譜采集方法，對樣本進行高通量、高速度采集，所得數據再進行深入解析和挖掘，是臨床蛋白質組學研究的利器。

> 技術原理

　　將整個質譜掃描質量范圍分為若干窗口，超高分辨質譜快速對每個窗口中的所有離子進行選擇、碎裂、檢測，從而無遺漏、無差異地獲得樣本中所有離子的全部碎片信息，不會造成低豐度離子信息的丟失，數據利用度大大提高，缺失值更少。DIA數據中包含了所有碎片離子的保留時間和強度信息，可實現對大量樣本中所有可檢測的蛋白譜峰信息進行完整采集和高重復性分析。

> 技術優勢

　　高準確性：基于二級離子定量，準確性高

　　高重現性：缺失值少，CV值低

　　高靈活性：蛋白數據庫可重復利用

　　高通量：可同時非標定量幾千個蛋白

> 應用領域

　　疾病標志物篩選、疾病機制研究、藥物作用靶點研究、用藥及預后研究、植物抗逆研究、營養吸收機制研究、發育機制研究、稀有物種研究、特殊功能蛋白質篩選。

> 技術路線

> 實驗儀器

　　Q Exactive HF-X （Thermo Fisher）

　　Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™（Thermo Fisher）

　　Orbitrap Exploris™ 480（Thermo Fisher）

Orbitrap Exploris™ 240（Thermo Fisher）

　　Orbitrap Fusion™ Tribrid™ （Thermo Fisher）

> 數據分析

　　數據質控結果；蛋白譜圖庫構建結果；蛋白定性定量結果；蛋白差異分析；火山圖（Volcano）；表達豐度箱式圖；平行樣本相關性分析；主成分分析（PCA）；層次聚類分析（Heatmap）；表達模式聚類分析；數據交疊分析（Venn）；差異蛋白GO功能注釋及富集分析；差異蛋白Pathway功能注釋及富集分析；蛋白互作網絡構建

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> 質量控制

　　樣本平行性質控

　　左右分別代表歸一化前、后的各樣本蛋白定量強度分布?？v軸為Log10蛋白定量強度，樣本對應箱形圖的中位數越一致，表明各樣品實驗操作一致性越高。歸一化后（右圖）的中位數應該處于一個水平線。

　　CV值區間統計

　　對#組樣本，經過#次技術重復鑒定到的 precursors的總鑒定數、CV（變異系數）<20%和 CV＜10%的鑒定數，分別如下圖所示。CV值為衡量指標中各觀測值變異程度的一個統計量，同組內CV越小，組內樣本的差異越小。QC樣本為混樣，可以用于衡量儀器和實驗操作引入的偏差。

> 數據可視化

　　QC樣本的相關性分析

　　所有數據可視化分析均由Perseus軟件作圖，首先對normalized intensity進行log2轉換——樣本分組。相關性分析主要針對有做生物學重復的實驗數據，用來評估平行樣本間個體差異的大小。采用pearson相關系數來衡量其相關性，R²越接近于1，圖中的點越靠近表示重復性越好。橫坐標和縱坐標分別為該組實驗樣品蛋白相對定量值的Log2對數值，任意兩組重復實驗的R²如圖上標注所示。

　　PCA分析

　　PCA分析通過對數據進行降維分析，從而檢測實驗組間的差異性及組內的重復性。PCA二維圖中，空間分布差異越小，表示兩個樣本的數據越接近。圖中每個點代表一個實驗樣本，并以不同顏色區分不同實驗分組。差異顯著的實驗，同一組內的不同樣本應該聚集在一個相對集中的范圍內，并可以與其他組的數據聚集區域區分開。

　　火山圖

　　通過火山圖（Volcano Plot）可以快速地查看蛋白在兩組樣品中表達水平的差異，以及差異的統計學顯著性。

　　差異蛋白層次聚類分析

　　聚類分析是模式識別和數據挖掘中普遍使用的一種方法，是基于數據的知識發現的有效方法，表達模式相似的蛋白通常具有相似的功能。對定量到的蛋白進行聚類（縱向），并根據蛋白表達量對樣本進行聚類（橫向），顏色對應蛋白質表達量。

　　基于樣本中篩選出的差異蛋白（Multi Sample Test ANOVA p-value≤0.05）進行層次聚類，對Normalized Intensity值在橫向和縱向上分別計算z-socre。

　　差異蛋白cluster聚類

　　基于層次聚類的結果，對各聚類中的蛋白在不同樣本中的表達量進行cluster聚類分析，直觀的反應出處理條件與蛋白表達水平的關系。橫坐標為處理條件，縱坐標為蛋白表達強度，顏色代表該蛋白與整體表達趨勢的偏離程度，暖色（紅）表示接近整體表達趨勢，冷色（綠）表示偏離整體表達趨勢。

> 功能分析

　　差異蛋白GO分類分析

　　OmicsBox軟件含有Blast2GO功能注釋模塊，可以對差異蛋白進行功能注釋分析，該模塊是一個綜合性的生物信息學工具，用于對基因或蛋白質序列進行進行注釋，獲取與這些蛋白質所有相關的功能信息，包括Gene Ontology（GO）和通路等注釋信息。由于背景注釋庫的局限性，因此不是所有的蛋白都能獲得相應的注釋信息。目前注釋信息比較全的物種為模式物種，即：人、大鼠、小鼠、擬南芥、水稻、斑馬魚、線蟲、大腸桿菌、酵母菌等。有些非模式物種的蛋白注釋信息不全，需要通過與模式物種或接近的注釋信息較多的近源物種的蛋白blast，為所研究的差異蛋白進行功能注釋。

　　GO總共有三個本體，分別描述基因的分子功能（MF）、所處的亞細胞位置（CC）、參與的生物過程（BP）。GO定義的術語有有向無環式（directed acyclic graphs, DAGs）的特點，隨著Level（代數）增加，下一級比上一級更為具體。例如，己糖合成途徑為第3級，那么，它的上一級為己糖代謝和單糖合成。

　　差異蛋白GO富集分析

　　GO 功能富集分析給出與蛋白質組背景相比，在差異表達蛋白中顯著富集的GO功能條目，從而給出差異表達蛋白與哪些生物學功能顯著相關。該分析首先把所有差異表達基因向Gene Ontology數據庫（http://www.geneontology.org/）的各個term映射，計算每個term的蛋白數目，然后找出與整個蛋白質組背景相比，在差異表達蛋白中顯著富集的條目。差異蛋白GO富集分析，由于考慮到了統計算法，結果比GO分類更為嚴格。

　　對篩選出的差異表達蛋白利用Blast2GO軟件進行GO富集分析，對富集到的前10個GO功能條目（按照-LOG10 p-value從大到小排序）。

　　差異蛋白KEGG信號通路分類分析

　　在生物體內，不同蛋白相互協調行使其生物學行為，基于Pathway的分析有助于更進一步了解其參與的通路。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是有關Pathway的主要公共數據庫。計算差異蛋白在不同Pathway 的分布情況，可以對差異蛋白進行歸類，尋找不同樣品的差異蛋白可能和哪些細胞通路的改變有關。

　　差異蛋白Pathway富集分析

　　根據篩選出的差異蛋白，計算差異蛋白同Pathway的超幾何分布關系，根據p-value判斷差異蛋白是否在相應Pathway中出現富集。通過差異蛋白的Pathway分析,可以找到差異蛋白顯著富集的Pathway條目,尋找不同樣品的差異蛋白可能和哪些細胞通路的改變有關，富集分析結果比分類結果更為嚴格。

　　對富集到的KEGG通路前20個（按照p-value由小到大的順序）作氣泡圖，圖中KEGG富集程度通過Rich factor、p-value和富集到此通路上的蛋白個數來衡量。其中Rich factor指該Pathway中富集到的差異蛋白個數與注釋蛋白個數的比值。Rich factor越大，表示富集的程度越大。p-value越接近于零，表示差異表達蛋白在該通路中的富集顯著性越可靠。

　　縱軸表示Pathway名稱，橫軸表示Rich factor（該Pathway中富集到的差異蛋白個數與注釋蛋白個數的比值）。富集因子越大，表示差異表達蛋白在該通路中的富集水平越顯著。圖中每一個圓點表示一個KEGG通路，圓點的大小代表富集到該通路的蛋白的數目，圓點的顏色代表p-value，p-value越小表示差異表達蛋白在該通路中的富集顯著性越可靠。

為了便于查看差異蛋白在通路圖中的分布情況，將差異蛋白標注到通路圖中，顯示顯著富集的通路圖。

　　相對于對照組來說，紅色框標記的為差異蛋白的節點，綠色框標記的為該物種特有的基因或酶?？騼鹊臄底执砻傅木幪枺‥C number），整個通路由多種酶催化的復雜生化反應構成。此通路圖中與差異表達蛋白相關的酶節點均用紅色標出，根據研究對象間的差異，重點研究某些代謝通路相關蛋白的差異表達情況，通過通路解釋表型差異的根源。

　　蛋白質相互作用網絡分析

蛋白質相互作用網絡分析通過兩種方法實現：第一種，IPA軟件基于自身數據庫分析所得蛋白的相互作用關系，獲得相互作用網絡圖；第二種，基于STRING、IntAct、Ihop、BioGRID、MINT、DIP等蛋白互作網絡數據庫獲得蛋白的相互作用關系，Cytoscape軟件對差異蛋白質進行相互作用網絡構圖。IPA軟件只可以對哺乳動物進行分析，其余動植物或菌類需要第二種方法分析。

　　圖中的節點（node）為蛋白質，邊為互作關系?；プ骶W絡中邊（edge）的顏色表示此邊連接的兩個節點間的互相作用的關系形式，不相連的蛋白節點間沒有已知的互作關系。

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動物樣本	堅硬動物組織（軟骨、硬骨和牙組織等）	≥500 mg
植物樣本	常規植物組織（草本植物，木本植物的葉和花，藻類植物，蕨類植物等）	≥800 mg
	堅硬植物組織（植物的根莖及果實種子等）	≥10 g
	花粉	≥200 mg
微生物樣本		≥300 mg
細胞樣本		≥2×10⁷
血清、血漿樣本		≥500 μL
體液	尿液	≥50 mL
	唾液	≥2 mL
	羊水	≥5 mL
	腦脊液	≥1 mL
	關節液	≥1 mL
	淚液	≥400 μL
蛋白質量/樣		100 μg

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